銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，我國礦泉水、包裝飲用水、化妝品等均需要進行該菌的檢驗，涉及檢驗標準為GB 8538-2016 《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》、《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》、GB7918.14-1987《化妝品微生物標準檢驗方法》等。檢驗銅綠假單胞菌我們不得不提熒光假單胞菌，其常作為檢驗過程中的陰性對照菌株。今天我們就一起來了解下銅綠假單胞菌以及他的這個同門師兄弟—熒光假單胞菌。
顯微鏡下如此相似的菌種，到底有什么不同呢？這些不同又怎么指導我們進行日常的微生物檢驗呢？
別急！我們先從菌株活化開始。
提到菌株活化，在座的看官們一定認為，So easy! 36℃，TSA，24h，有氧培養(yǎng)！這個我們經(jīng)常操作，一定沒問題的！可是一上手操作，24h后從36℃培養(yǎng)箱里拿出來一看，沒長？抑或只長了少量菌落？
此時的您是不是第一想到的是這個菌一定有問題！事實是什么呢？我們先看看標準的操作方法吧！
嗯，溫度出錯啦！記得30℃以下才能讓我們熒光假單胞菌活化出來哦！看看比對的結(jié)果吧！
熒光假單胞菌活化于TSA平板
菌株已經(jīng)準備就緒，那我們繼續(xù)看看熒光假單胞菌與銅綠假單胞菌在培養(yǎng)過程中的差異。
先從平板開始說起：
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假單胞菌CN瓊脂：我們可以看到銅綠假單胞菌，36℃培養(yǎng)生長良好，為藍綠色菌落；熒光假單胞菌在CN瓊脂上36℃生長較弱，25℃生長良好，且為淡黃色菌落，置于365nm紫外燈下觀察熒光反應，熒光假單胞菌熒光明顯。
十六烷三甲基溴化銨瓊脂：銅綠假單胞菌36℃培養(yǎng)，生長良好，為黃綠色菌落，而熒光假單胞菌36℃未生長，25℃生長良好，且為淡黃色菌落。
乙酰胺瓊脂：銅綠假單胞菌生長利用乙酰胺產(chǎn)生堿性代謝產(chǎn)物，使得培養(yǎng)基顏色變?yōu)槊导t色，而熒光假單胞菌36℃不生長，于25℃培養(yǎng)生長良好且未產(chǎn)生堿性物質(zhì)則培養(yǎng)基不變色。
看了上面的結(jié)果，您一定想說“熒光假單胞菌在36℃不生長，沒有必要用它做為陰性對照了！”其實也不能斷然下結(jié)論，我們接著往下看！
將熒光假單胞菌于TSA中，25-30℃培養(yǎng)，得到生長良好的純菌落，以用于后續(xù)生化鑒定實驗的陰性對照。
硝酸鹽產(chǎn)氣實驗《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》
硝酸鹽還原試驗是根據(jù)某些細菌能還原硝酸鹽。并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣，觀察硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小導管中有氣體者，即為陽性。銅綠假單胞菌應呈陽性，熒光假單胞菌呈陰性。從實驗結(jié)果我們可以看到銅綠假單胞菌出現(xiàn)明顯產(chǎn)氣現(xiàn)象，熒光假單胞菌在28℃和36℃均可正常生長，并呈現(xiàn)陰性反應。
? ?明膠液化實驗
明膠是肽分子聚合物質(zhì)，是膠原蛋白多級的水解產(chǎn)物，溶點在24-28℃之間，即在低于溶點時明膠處于固體狀態(tài)。部分細菌可以產(chǎn)生胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，變?yōu)榱鲃拥囊后w狀態(tài)。操作時，將新鮮活化的菌株穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，置于相應溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束將培養(yǎng)物置于2-8℃冰箱冷藏，30min后進行觀察，若培養(yǎng)物為流動狀態(tài)說明明膠液化陽性，若為凝固狀態(tài)則為陰性。銅綠假單胞菌為陽性，熒光假單胞菌為陰性。
明膠液化實驗
（熒光假單胞菌28℃培養(yǎng)-熒光假單胞菌36℃培養(yǎng)-銅綠假單胞菌）
乙酰胺還原實驗
乙酰胺肉湯中的主要成分為乙酰胺，微生物代謝分解乙酰胺酶將乙酰胺分解，產(chǎn)生NH4+；鈉氏試劑主要成分為氯化汞（HgCl2）和碘化鉀（KI），化學反應式如下：
鈉氏試劑：HgCl2+2KI==2KCl+HgI2；
鈉氏試劑與NH4+反應：
我們?nèi)庋劭吹降募t色的沉淀就是HgO·Hg(NH2)I，這個反應非常快，所以觀察結(jié)果時在培養(yǎng)物中滴加鈉氏試劑后在10s內(nèi)觀察結(jié)果。銅綠假單胞菌乙酰胺還原反應陽性；熒光假單胞菌還原反應陰性。
為了保證結(jié)果的準確性，操作過程中可以挑取菌落接種以加大接菌量，并且培養(yǎng)時間要充分，以保證得到大量的代謝產(chǎn)物！
乙酰胺肉湯實驗（滴加鈉氏試劑前）?
空白-熒光假單胞菌28℃培養(yǎng) –熒光假單胞菌36℃培養(yǎng) -銅綠假單胞菌
乙酰胺肉湯實驗（滴加鈉氏試劑后）
綠膿菌素測定實驗：
綠膿菌素是銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)生的胞外次級代謝產(chǎn)物，部分有機溶劑可促進綠膿菌素的產(chǎn)生，其可發(fā)生可逆的氧化還原作用，堿性條件時呈氧化型藍色，酸性條件時呈還原型紅色。在進行綠膿菌素測定時，若該菌可代謝產(chǎn)生綠膿菌素，向培養(yǎng)物中加入三氯甲烷使得色素溶出，再繼續(xù)滴加1mol/L鹽酸，可出現(xiàn)肉眼可見的紅色還原型產(chǎn)物。
銅綠假單胞菌若產(chǎn)生綠膿菌素，培養(yǎng)物為藍綠色，加入氯仿后溶液呈淡藍色，繼續(xù)滴加1mol/L鹽酸，溶液表面出現(xiàn)紅色。熒光假單胞菌并不能出現(xiàn)上述反應，為陰性。
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銅綠假單胞菌+氯仿+鹽酸后綠膿菌素測定實驗
看完生化反應結(jié)果，您是否明白了，雖然熒光假單胞菌在部分培養(yǎng)基中36℃生長較弱，但是并不影響他參與生化反應的對照作用，在以上生化鑒定過程中，熒光假單胞菌在36℃生長良好，并呈陰性反應。
所以如果您想看到平板上的陰性對照反應，可以把平板置于30℃以下培養(yǎng)，如果是微量生化鑒定反應可以和樣品及陽性對照一同放入36℃進行培養(yǎng)即可。
（說明：本次實驗圖片中菌株來源：銅綠假單胞菌 CMCC 10104；熒光假單胞菌 CICC 21612）
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銅綠假單胞菌檢測用培養(yǎng)基列表
參考文獻
金杰人，魯凱，珩肖明 熒光假單胞菌的應用與展望[J].上海師范大學學報（自然科學版）2019 .48（5）：526-535
徐笑洋,邱晨.?銅綠假單胞菌生物膜耐藥的研究進展[J].?廣東醫(yī)學. 2012(10)
靳磊,范貴生,呂加平.耐熱性脂肪酶及其對UHT乳品質(zhì)的影響[J].?食品研究與開發(fā). 2008(04)
常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 科學出版社 , 東秀珠,蔡妙英等編著, 2001
伯杰細菌鑒定手冊[M]. 科學出版社 , ()布坎南(R.E.Buchanan)等編, 1984
Murat?Ozda. ?A new strategy for?the?efficient production of?pyocyanin, a?versatile pigment, in?Pseudomonas aeruginosa OG1 via?toluene addition. 3 Biotech, 2019, Vol.9 (10), pp.1-8
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